Седемдесет години ембриолозите живееха в прекалено подреден свят. Моделът, формулиран от Питер Нювкуп през 1952 година, беше от онези теории, които са толкова логични, че никой не си прави труда да ги поставя под сериозно съмнение. Според него първичната нервна тъкан е напълно пластична, а химическият градиент – нарастващата концентрация на протеини от бъдещата глава към опашката – просто показва на всяка клетка какво да стане. Изглеждаше чиста физика. Само че природата рядко работи по толкова гладки инженерни чертежи, а лабораторията на Кайл Лох в Станфорд счупи тази илюзия.
Екипът на Лох просто спря да разчита на класическите хистологични оцветявания и влезе в лабораторията с молекулярен инструмент от ново поколение. Използвайки човешки плурипотентни стволови клетки и ембриони от мишки, те изолираха процеса на гаструлация ин витро. Когатоблокираха основните морфогенетични пътища – BMP, TGF-β, FGF/ERK и WNT – клетките логично изоставиха възможността да станат черва или мускули и се превърнаха в чиста ектодерма. Очакванията бяха тук да се появи хомогенната „универсална“ нервна тъкан на Нювкуп.
Реалността се okaza доста по-сурова. На втория ден от култивирането – едва 48 часа след началото – хомогенната маса се разцепи на две групи без никакви междинни форми. Първата популация задейства гена OTX2 и напълно блокира GBX2, давайки началото на предния и средния мозък. Втората група направи точно обратното: затвори OTX2, задейства GBX2 и активира пакета HOX гени, които отговарят за задния мозък – малкия мозък, моста и продълговатия мозък. Това разделение се случи далеч преди да се появят каквито и да е анатомични структури или класически маркери за зрели невронални стволови клетки като PAX6 или SOX1. Решението беше взето в архивното гробище на генома много преди самият орган да бъде скициран.
Дълги години опитите на лабораториите да отгледат специфични неврони от мозъчния ствол завършваха с фиаско тъкмо поради погрешни методологични предпоставки. Тъй като се смяташе, че задните структури просто изискват по-висока концентрация на WNT протеини, учените заливаха културите с WNT стимулатори. Резултатът обаче не беше мозъчен ствол, а тъкан на гръбначния мозък с висока експресия на BRACHYURY и CDX2. Биохимичният код за задния мозък се оказа съвсем различен и напълно парадоксален: пълно блокиране на WNT, BMP и TGF-β, комбинирано с едновременно подаване на фибробластен растежен фактор (FGF) и ретиноева киселина. Нито един от тези фактори самостоятелно не постига резултат.
Генетичната ключалка на 48-ия час
След като установиха съществуването на двете групи, изследователите опитаха да пречупят пластичността им – класически метод за проверка в ембриологията. Те взеха клетки от предния невроектодерм на 48-ия час и ги потопиха в химическия коктейл за заден мозък, а задните клетки прехвърлиха в среда за преден. Резултатът беше пълна резистентност. Нито предните клетки започнаха да синтезират HOXA1 или MAFB, нито задните активираха SIX3 или FOXG1. Дори когато смесиха двете популации в съотношение 1:1, за да задействат т.нар. „ефект на общността“, клетките запазиха оригиналната си идентичност.
Причината за този инат не е в повърхностните рецептори, а в самата структура на хроматина. Анализът с OmniATAC-seq разкри физическа блокировка: в клетките на предния мозък участъците от ДНК, отговарящи за задните гени, са плътно навити около ядрените протеини и физически недостъпни за транскрипционните фактори. В задните клетки ключалката е щракнала над гените на кората. Информационните канали са затворени на епигенетично ниво.
За да проверят дали това не е просто лабораторен артефакт на ин витро системите, Станфордският екип пренесе опитите върху живи миши ембриони чрез технологията за проследяване на родословието. Използвайки трансгенни мишки Gbx2-CreER и репортерната система ROSA26-tdTomato, те маркираха клетъчната линия точно в момент E7.5 от бременността. Резултатите, анализирани на ден E18.5, бяха безапелационни: флуоресцентният червен протеин се появи строго в структурите на мозъчния ствол, без нито една клетка да препречи границата към средния или предния мозък. Тестовете със системата Confetti, която оцветява клетките в различни цветове, потвърдиха, че едва 4.5% от клетъчните клъстери се намират на анатомичната граница – останалите 95.5% принадлежат строго на единия или другия произход.
Тази разлика не е просто академична дъвка. Задният мозък контролира фундаменталната механика на оцеляването – дишане, вазомоторен тонус, сърдечен ритъм и гълтателния рефлекс. При заболявания като амиотрофична латерална склероза (АЛС) и спинална мускулна атрофия (СМА) умират точно моторните неврони в ромбомери 5 и 6 на задния мозък, които инервират фаринкса през глософарингеалния нерв. Поради липсата на правилен протокол, досега беше невъзможно в лабораторни условия да се генерират точно тези клетки за изпитване на лекарства. Новата двустепенна методика вече позволява получаването на биологично активни PHOX2B+ и HOXA3+ неврони. При тестове тези лабораторно отгледани мрежи генерираха редовни акционни потенциали и реагираха моментално на оптогенетична стимулация при 560 нанометра.
